Биохимические методы исследования яэкулята

исследование эякулята

Практическое значение ряда этих биохимических исследований не очень велико.

Нельзя, например, на основании определения лимонной кислоты, фосфатазы, гиалуронидазы и белковых фракций сделать надежное заключение об оплодотворяющей способности эякулята и причине бесплодия. Необходимо поэтому, чтобы эти исследования проводились и дальше с тем, чтобы на основании большого количества тщательно проведенных наблюдений можно было сделать обоснованные заключения о значении в процессе оплодотворения обнаруженных в семени различных химических веществ и установить показания к их определению в медицинской практике.

Определение фруктозы и фруктолиза.

В настоящее время наибольшее практическое значение имеет количественное определение фруктозы в эякуляте. Вопрос о фруктозе и ее значении в способности мужчины к оплодотворению изложен в разделах «Семенные пузырьки» и «Семя».

Определение концентрации фруктозы в эякуляте важно, так как:

  1. первоначальная концентрация фруктозы позволяет высказать суждение о функции лейдиговских клеток;
  2. повторное определение концентрации фруктозы через определенные более или менее продолжительные промежутки времени дает возможность судить об обмене веществ сперматозоидов и их жизнеспособности.
  3. Необходимо принять решение о назначение препаратов для потенции, таких как тадалафил или варденафил.

Для выявления андрогенной функции лейдиговских клеток возможен, как известно, прямой путь — определение 17-кетостероидов в моче. Однако этот путь не позволяет делать непосредственное заключение об андрогенной функции яичек, так как в группу 17-кетостероидов входят, как известно, дериваты андрогенных гормонов, выделяемых как надпочечниками, так и половыми железами. Только 1/з кетостероидов происходит от тестостерона яичек, в то время как 2/з — из коры надпочечников.

По наблюдениям Waster, ling, количество сперматозоидов меньше 40 млн./мл потребляет в 1 час 54 у от 40 до 100 млн./мл—140 у и количество свыше 100 млн./мл — 274 у фруктозы. Среднее количество фруктозы в эякуляте равно 290 мг%. Это количество фруктозы является достаточным источником энергии для 100 млн. сперматозоидов в 1 мл на 20 часов, если 70% из них к этому сроку остаются подвижными. Поскольку, однако, через 20 часов после эякуляции теряют свою подвижность значительно больше чем 70% сперматозоидов, то количество фруктозы в эякуляте окажется достаточным на более продолжительное время, если сперматозоиды сохраняют свою способность к фруктолизу. Таким образом, продолжительность оплодотворяющей способности сперматозоидов зависит как от количества фруктозы, так и от способности сперматозоидов к фруктолизу. Эта способность может исчезать у физиологически полноценных сперматозоидов с возрастом и увеличением продолжительности их существования и оказаться меньшей с самого начала у первично неполноценных сперматозоидов. Для отделения первично полноценных от неполноценных сперматозоидов весьма пригодным тестом оказался именно фруктолиз. При этом практически для этой цели вполне достаточно определения фруктолиза через 2часа после эякуляции. Обычно к этому времени в нормальном эякуляте содержание фруктозы падает на 200—800 у/мл.

Определение первоначального количества фруктозы в эякуляте и индекса фруктолиза производится одинаково.

  • Фруктоза является единственным физиологическим субстратом для образования в семени молочной кислоты. На этом основан количественный колориметрический метод с резорцином для определения скорости расщепления фруктозы в семени. Метод определения фруктозы разработан Roe (1934). В основу его положена цветная реакция, открытая Seliwanoff.
  • Определение лимонной кислоты основано на ее свойстве под действием перманганата калия и брома окисляться до пентабромацетона. Последний под действием раствора сульфида натрия в этиленгликоле окрашивается в желтый цвет и определяется фотометрически.

К 0,2 мл эякулята добавляют 3,8 мл дистиллированной воды и 2 мл 60% трихлоруксусной кислоты для осаждения белка; встряхивают в течение 10 минут и оставляют при температуре — 20°. На другой день смесь фильтруют. 3 мл фильтрата (содержащего 0,1 мл эякулята) разводят с 1 мл серной кислоты (15nH2S04), 0,2 мл 1 молярного раствора бромистого калия (КВг) и 0,8 мл 0,3 молярного раствора перманганата калия (КМп04); перемешивают. Через 15 минут для удаления перманганата калия добавляют 0,5 мл 1,5 молярного раствора азотистокислого натрия (NaN02), а затем в полученную бесцветную жидкость для освобождения от излишков нитрата — 0,5 мл 2 молярного раствора мочевины. После этого экстрагируют пентабромацетон путем добавления 10 мл петролейного эфира и встряхивания в течение минуты. Под водоструйным насосом пилений (водный) слой удаляют капиллярной пипеткой, а слой петролейного эфира дважды промывают 3 мл дистиллированной воды, встряхивают в течение 15 секунд и каждый раз удаляют капиллярной пипеткой водный слой. В промытый водой петролейный эфир добавляют 5 мл реактива из натрия сульфида (сернистого натрия) в этиленгликоле. Для приготовления этого реактива растворяют 5 г кристаллического сернистого натрия в 60 мл воды и прибавляют 40 мл этиленгликоля. После добавления реактива жидкость встряхивают в течение минуты, удаляют петролейный «эфир под водоструйным насосом и определяют оптическую плотность желтоокрашенного раствора на спектрофотометре.

Расчет производится по калибровочной кривой. Для ее построения из стандартного раствора лимонной кислоты берут такие количества, чтобы они содержали от 0,05 до 0,25 мг лимонной кислоты.

Определение гонадотропинов.

Нарушение функции яичка может сопровождаться повышенным, пониженным или нормальным выделением гонадотропинов с мочой. Для дифференциального диагноза между гипер-, нормогонадотропным гипогона- дизмом большое значение имеет определение гонадотропинов в моче. Результаты исследования позволяют сделать заключение о гонадотропной активности передней доли гипофиза и имеют значение для назначения лечения. Гипофизарные гонадотропины выделяются в неизменном виде с мочой и выпадают от прибавления 96% алкоголя. Пользуясь методом Цондека и особенно его модификацией (Klinefelter, Albright, Griswold), можно на матке инфантильных мышей определить количество гонадотропинов. После подкожных инъекций водного раствора очищенного экстракта мочи при наличии гонадотропного гормона наступает увеличение веса матки и ее придатков, которое удается констатировать часто микроскопически. При этом остается скрытым, какой именно из гонадотропных гормонов (FSH или ICSH) обнаружен. Преимущественно, однако, эта биологическая реакция указывает на наличие в экстрате мочи FSH; весьма часто обна руживают в нем и небольшое количество IGbH. Поэтому правильнее говорить о тесте на гонадотропин.

У нормального половозрелого человека количество выделяемых в течение 24 часов гонадотропинов в моче составляет, по данным одних авторов от 10 до 55 ме, по данным других - от 20 до 40 ME. Количество ниже 10 и больше 52 ME является патологическим. Следует отметить, что в противоположность биопсии определение гонадотропинов в моче не позволяет судить о степени повреждения семенного эпителия, поэтому нельзя исключить гистологическое исследование.

Для определения увеличенного количества гонадотропного гормона из ночной порции профильтрованной мочи отбирают количество, соответствующее выделению ее за 1 ½ часа, осаждают четырехкратным объемом охлажденного спирта и сохраняют в течение 12-16 часов в холодильнике. Жидкость над выпавшим осадком отсасывают. Осадок с оставшимся количеством надосадо-чной жидкости центрифугируют и дважд промывают 15 мл спирта, а затем - один pаз 15 мл эфира. Каждый раз тщательно размешивают осадок с промывной жидкостью и центрифугируют.

Осадок высушивают в вакуумэксикаторе или пр комнатной температуре; в таком состоянии он долго сохраняется. За день до проведения пробы к осадку добавляют 12 мл дистиллированной воды и для полного растворения оставляют в холодильнике до следующего дня. Из основного раствора готовят различные0,5 мл цельного и каждого из разведенных растворов вводят подкожно 5 раз в течение 3 дней (1-й и 2-й день по 2 раза и 3-й день 1 раз) неполовозрелым (21-дневным) мышам (самкам). Для каждого разведения используют по 2 подопытные и контрольные мыши. Через 72 часа после первой инъекции мышей забивают и вскрывают. Отсепарованную от яйцепроводов матку взвешивают на крутильных весах. Последнее разведение осадка, вызывающее увеличение веса матки, показывает количество выделяемого гонадотропного гормона в мышиных единицах (ME) в течение 24 часов.

Тест с хорионгонадотропином.

Для дифференциального диагноза между первичным (гипер-гонадотропным) и вторичным (гипогонадотропным) гипогонадизмом может быть использован тест с хорион-гонадотропином. Он дает возможность установить, существует ли в лейдиговских клетках способность к выработке тестостерона.

Тест Heller, Nelson. Два раза в день в течение 3 недель вводят по 750 ME хорионгона-дотропина. Если после этого появляются клинические симптомы стимуляции функций гениталий, то тем самым подтверждается гипофункция гипофиза как причина недостаточности яичек.

По наблюдениям Weller, при гипогонадотропном гипогонадизме удается достигнуть стимуляции лейдиговских клеток и повышения выделения 17-кетостероидов более чем на 50% исходной величины назначением по 1000 ME гонадотропина в течение 15 дней. При первичном гипогонадизме подобного увеличения 17-кетостероидов не происходит. Действие тестостерона не может служить в качестве пробы ех juvantibus, так как половые признаки могут после гормонотерапии появляться или усиливаться при любой форме недостаточности яичек.

Определение 17-кетостероидов.

Известное диагностическое значение при определении функциональной недостаточности половых желез имеет определение общего количества содержащихся в моче стероидов с кетоновой группой, так называемых 17-кетостероидов, куда входят дериваты андрогенных гормонов, выделяемых как надпочечниками, так и половыми железами. Определение 17-кетостероидов у мужчин показывает функциональное состояние надпочечников и мужских половых желез. Считают, что 2/з нормальных 17-кетостероидов вырабатывается у мужчин в коре надпочечников и 1/з — в семенниках. Количество 17-кетостероидов зависит от возраста: у детей до полового созревания и у пожилых лиц количество их по сравнению с мужчинами в активном половом возрасте уменьшено. Выделение 17-кетостероидов за сутки составляет для мужчин 10—21 мг, для женщин — 3,5-14 мг.

В клинико-диагностическом отношении следует поэтому учесть довольно широкие индивидуальные и возрастные колебания, точно так же как компенсаторную гормональную деятельность коры надпочечников. Определение 17-кетостероидов имеет большое практическое значение для диагностики вторичной недостаточности яичек при гиперфункции коры надпочечников.

В подобных случаях в моче не находят гонадотропного гормона. Выделение же 17-кетостероидов увеличено особенно значительно при опухоли коры надпочечников.

Для определения 17-кетостероидов применяют реакцию Zimmermann в различных модификациях.

Для уточнения вопроса об участии надпочечниковых фракций андрогенов в изменениях обмена стероидных гормонов, помимо определения 17-кетостероидов, требуется вычисление бета-фракции (эпиандростерон, дегидроэпиандростерон). Эпиандростерон и дегидроэпи- андростерон являются конечными продуктами метаболизма исключительно надпочечниковых гормонов в отличие от альфа-фракции (андростерон, зтиохоланолон и др.), которые являются метаболитами половых гормонов. Обычно определение бета-фракции проводят по вычислению дегидроэпиа-ндростерона (ДНА). Среднее выделение ДНА здоровыми мужчинами выражается величиной 1,9 мг за 24 часа с колебаниями от 1,6 до 2,2 мг. ДНА составляет 7—12% от общей суммы 17-кетостероидов. При гиперфункции и гиперплазии коры надпочечников, а также при опухоли надпочечников выделение ДНА увеличивается. Гипофункция коры надпочечников сопровождается уменьшением выделения ДНА, при этом уменьшается соотношение ДНА и 17-кетостероидов до 0,03—0,04, в то время как в норме это соотношение равно 0,08—0,14. В биохимической лаборатории ЦКВИ ДНА определяют по методу, разработанному Е. М. Рахмалевич и В. Г. Орловой.

В сомнительных случаях у больных бесплодием приходится определять также и количество эстрогенов в моче.